Histokit® HONGOS – GROCOTT

 

Reactivo de Diagnostico de Uso in Vitro                                                         

2000940003

30 determinaciones

 

Uso previsto:

Histokit® HONGOS - GROCOTT se emplea como herramienta para diagnostico en exámenes histológicos y citológicos en medicina humana, veterinaria e investigación.

Este método de tinción es uno de los mejores para visualizar al microscopio óptico una variedad de organismos fúngicos que incluyen: Pneumocystis, Aspergillus, Blastomyces, Candida e Histoplasma.

Su uso está indicado en cortes de tejidos fijados, embebidos en parafina y en extendidos citológicos.

 

Principio:

El método de Histokit® Hongos - Grocott consta de 3 etapas:

1)            Oxidación, con Acido Crómico, de los polisacáridos presentes en la pared celular, permitiendo el posterior ingreso de Nitrato de Plata.

2)            Impregnación con Solución de Metenamina – Plata.

3)            Reducción de las sales de Plata al entrar en contacto con los grupos aldehídos presentes en la capsula de los microorganismos a identificar.

4)            Tinción de contraste

 

Reactivos y presentación:

Kit para la realización de 30 determinaciones (de acuerdo al Procedimiento de uso, en base al volumen de 6 cubetas Coplin con capacidad para 5 portaobjetos por procedimiento realizado). Éste valor podría variar dependiendo de la modalidad de trabajo aplicada y las variaciones de volumen o gotas utilizados en cada paso, capacidad de las cubetas coplin o recipientes utilizados, etc.

Contiene:

Solución A: Acido Crómico (1 frasco gotero x 40 mL)

Solución B: Sodio Metabisulfito (1 frascogotero x 40 mL)

Solución C: Plata Nitrato (1 frasco x 10 mL)

Solución D: Metenamina (3 frascos x 47,5 mL)

Solución E: Sodio Borato (1 frasco x 20 mL)

Solución F: Verde Luz (1 frasco gotero x 40 mL)

Pipeta de transferencia Pasteur graduada de 3,0 mL (3 unidades)

 

Nota: el tamaño de los frascos provistos en el kit puede no ser representativo del volumen de su contenido, pero facilitara la manipulación por parte del operador.

 

Materiales requeridos no suministrados:

•             Papel de filtro.

•             Etanol 96º (cat. 2000937500) o Deshidratante 90° (cat. 2000938300)

•             Etanol absoluto 100° (cat. 2000165400) o Deshidratante 100° (cat. 2000948300)

•             Xileno (cat. 2000166200) o sustituto Bioclear (cat. 2000942700)

•             Bálsamo de Canadá sintético (cat. 2000130300)

•             Histokit® Oro - Virofijación (cat. 2000932803). Ver “Procedimiento de Uso - Consideraciones previas a la realización del procedimiento” en punto 9.

 

Preparación de los reactivos:

Todas las soluciones del presentes kit se encuentran en concentraciones listas para usar. No es necesaria la dilución, ni la adición de componentes para su aplicación. Cualquier agregado a su composición original puede alterar su función y/o estabilidad.

 

Para realizar las determinaciones, se debe preparar previamente:

 

1-            Preparación SOLUCION STOCK de Metenamina Plata:

Tomar un frasco de Solución D de Metenamina (47,5 mL) y agregarle 2,5 mL de Nitrato de Plata (Solución C) utilizando la pipeta Pasteur graduada.

Solución C (Plata Nitrato) ……………… 2,5 mL  

Solución D (Metenamina) .…….....….....47,5 mL  

Identificar y etiquetar la Solución Stock de Metenamina Plata con la etiqueta provista en el kit, registrando fecha de preparación y vencimiento correspondiente.

Esta Solución Stock debe almacenarse en refrigerador (entre 2ºC a 8°C) y ausencia de luz. Usar dentro de los 3 meses de preparada.

 

2-            Preparación SOLUCION de TRABAJO de Metenamina Plata:

Preparar la siguiente mezcla en una cubeta de tinción tipo Coplin de vidrio para procedimiento tradicional o en un Coplin de polipropileno en caso de realizar el procedimiento rápido

Solución Stock Metenamina Plata (Frascos C + D) ...... 25 mL 

 Agua purificada ………………..…………...…………….. 25 mL

Solución E (Sodio Borato) ….………............................... 2,5 mL

Preparar al momento del uso. Una vez usada, descartar.

 

Procedimiento de uso:

Consideraciones previas a la realización del procedimiento:

1.            Realice el procedimiento de tinción a muestras recientemente cortadas y montadas sobre portaobjetos limpios y secos.

2.            Los cortes / secciones histológicas deben tener un espesor de 4 micrones.

3.            Evitar la contaminación de los cortes/secciones. No dejar las preparaciones expuestas al aire.

4.            Siempre manipule las muestras/secciones con guantes.

5.            Adherir y desparafinar los cortes histológicos en estufa durante 24 horas a 60ºC.

6.            Use siempre agua purificada o destilada de excelente calidad.

7.            Use materiales de vidrio y herramientas de trabajo bien limpios.

8.            No toque nunca las soluciones de Histokit® Hongos - Grocott con objetos metálicos (pinzas, etc.)

9.            Para una óptima diferenciación y contraste de tinción se recomienda previo a la contratinción realizar virado con Cloruro de Oro y remover el excedente de metales débilmente unidos al tejido con Tiosulfato de Sodio, aplicando Histokit® Oro – Virofijación (cat. 200932803, reactivo no provisto). Ver Nota (2*)

10.              Incorpore un caso “control positivo” para una correcta validación del procedimiento.

 

Procedimiento tradicional:

•             Previamente desparafinar los preparados/secciones con Xileno o Bioclear® e hidratar con alcoholes o deshidratantes descendentes en graduación hasta el agua purificada.

•             En el caso de extendidos citológicos, previo iniciar el procedimiento, fijar las muestras con Alcohol durante 15 minutos.

•             Precalentar la SOLUCION de TRABAJO de Metenamina Plata entre 45°C y 60°C y un frasco adicional con Agua purificada (para control de tinción) en un baño de agua térmico o en estufa aproximadamente de 20 a 30 minutos antes de su uso.

 

Paso      Reactivo / Aplicación                                    Temperatura     Tiempo                Observaciones

1             Agua purificada / Lavado                             ambiente            n/a                         n/a

2             Solución A (Acido. Crómico) / Cubrir la

muestra (1 mL)                                                ambiente            60 minutos         n/a

3             Agua corriente / Lavado                              ambiente            2 minutos           n/a

4             Agua purificada / Cubrir la muestra

(1 mL)                                                                  ambiente            n/a                         n/a

5             Solución B (Sodio Metabisulfito) /

Cubrir la muestra (1 mL)                              ambiente            1 minuto             n/a

6             Agua purificada / Lavado – varios

cambios                                                              ambiente            n/a                         n/a

7             Colocar muestras en Solución de

Trabajo Metenamina-Plata “precalentada”

en Coplin de Vidrio o Plástico                    58/60°C                15 minutos         n/a

8             Controlar al microscopio (1*)                     58/60°C                n/a                         n/a

9             Agua purificada / Lavado                             ambiente            n/a                         n/a

10           HistoKit Oro Virofijación – Solución A /

Cubrir la muestra (2*)                                  ambiente            1 minuto             Opcional

11           Agua purificada / Lavado (2*)                    ambiente            n/a                         Opcional

12           HistoKit Oro Virofijación – Solución B /

Cubrir la muestra (2*)                                  ambiente            2 minutos           Opcional

13           Agua purificada / Lavado (2*)                    ambiente            n/a                         Opcional

14           Solución F ( Verde Luz) / Cubrir la

muestra (1 mL)                                                ambiente            2 minutos           n/a

15           Deshidratar, aclarar y montar con

Bálsamo                                                             ambiente            n/a                         n/a

 

Nota:  1 mL = 20 gotas

n/a: No aplica

 

Notas técnicas:

(1*)Controlar al microscopio: extraer el preparado “control positivo” de la Solución de Trabajo Metenamina-Plata y sumergir en el frasco con agua purificada a igual temperatura de incubación. Las muestras presentaran una tonalidad marrón claro o “marrón tabaco”. De ser insuficiente la impregnación regresar las muestras y continuar incubando con Solución de TrabajoMetenamina-Plata a temperatura durante 5 a 10 minutos más y volver a controlar. Luego continuar con el Paso 9. A partir de los 35 minutos la solución puede comenzar a precipitar, virando a color negro.

(2*)  Pasos 10 a 13: Procedimiento de Virofijación con Oro opcional (ver Punto 9. en “Procedimiento”). Reactivo no provisto.

 

Procedimiento rápido:

•             Previamente desparafinar los preparados/ secciones con Xileno / Bioclear® e hidratar con alcoholes o deshidratantes descendentes en graduación hasta el agua purificada.

•             En el caso de extendidos citológicos, previo iniciar el procedimiento, fijar las muestras con Alcohol durante 15 minutos.

 

Paso      Reactivo / Aplicación                                     Temperatura     Tiempo                Observaciones

1             Agua purificada / Lavado                             ambiente            n/a                         n/a

2             Precalentar una alícuota de 1 mL de

Solución A (Acido. Crómico) en

microondas o estufa (3*)                            Aprox. 60°C        Necesario           n/a

3             Solución A “precalentada” (Acido

Crómico) / Cubrir la muestra (1 mL)        Aprox. 60°C        5 minutos           n/a

4             Agua corriente / Lavado                              ambiente            2 minutos           n/a

5             Agua purificada / Cubrir la muestra

(1 mL)                                                                  ambiente            n/a                         n/a

6             Solución B (Sodio Metabisulfito) /

Cubrir la muestra (1 mL)                              ambiente            1 minuto             n/a

7             Agua purificada / Lavado – varios

cambios                                                              ambiente            n/a        

Servicio Técnico:

Nuestro equipo de cientificos tiene experiencia en todas las areas de investigación.

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